Atlantische heilbot

door Constantinos C Mylonas, Projectcoördinator (HCMR, Greee), Birgitta Norberg, Voortplanting en genetica - leider van de Atlantische heilbot (IMR, Noorwegen), Kristin Hamre, Voeding - Leider Atlantische heilbot (NIFES/IMR, Noorwegen), Torstein Harboe, Larval Husbandry - leider van de Atlantische heilbot (IMR, Noorwegen), Sonal Patel, Fish Health - Leider Atlantische heilbot (IMR, Noorwegen; momenteel bij VAXXINOVA, Noorwegen) en Rocio Robles, Disseminatieleider (CTAQUA, Spanje)

Een van de soorten die is opgenomen in het door de EU gefinancierde DIVERSIFY-project, die tussen 2013 en 2018 liep, was de Atlantische heilbot (Hippoglossus hippoglossus). De Atlantische heilbot is 's werelds grootste platvis en kan een gewicht bereiken van meer dan 300 kg. Het wordt zeer gewaardeerd op markten over de hele wereld, maar de beschikbaarheid van wilde Atlantische heilbot neemt af.

Noorse bestanden zijn geclassificeerd als levensvatbaar, maar de visserij is onderworpen aan strikte regelgeving. Dit heeft geleid tot een grotere marktvraag naar Atlantische heilbot, waaraan de visserij alleen niet kan voldoen.

De Atlantische heilbot (zie figuur 1) is een halfvette vis, rijk aan omega-3 vetzuren, met een karakteristiek schilferig wit vlees met weinig botten. Gekweekte Atlantische heilbot heeft een uitstekende reputatie en wordt traditioneel op de markt gebracht als grote vissteaks of schnitzels. Het kan gerookt of gemarineerd worden in de typisch Scandinavische stijl. Deze kenmerken hebben geleid tot de opname van Atlantische heilbot in DIVERSIFY, als een geweldige kandidaat voor vissoorten en productdiversificatie in de Europese aquacultuur.

Onderzoeks- en teeltinspanningen van Atlantische heilbot begonnen in de jaren '80, en hoewel de totale jaarlijkse productie van gekweekte Atlantische heilbot toeneemt, het bereikte nog steeds slechts ~ 1600 ton in 2017 (Noorse visserijdirectie).

In Europa, In Noorwegen en Schotland bestaan ​​er Atlantische heilbotkwekerijen. De gewenste marktomvang is 5-10 kg en de productietijd is momenteel vier tot vijf jaar. Ondanks een aanzienlijke onderzoeksinspanning tussen 1985 en 2000, de gecompliceerde levenscyclus van de Atlantische heilbot zorgde ervoor dat de aquacultuur langzamer ging, en daarna is er zeer weinig onderzoeksfinanciering toegekend.

Echter, gedurende deze tijd hebben de boeren langzame maar gestage vooruitgang geboekt om de productiestabiliteit te verbeteren, en de belangstelling voor zowel kooi- als landcultuur groeit. De resterende knelpunten voor een verhoogde en stabiele productie hebben te maken met een constante aanvoer van jongen en de noodzaak om de productietijd te verkorten.

Dit laatste kan worden bereikt met de recente invoering van 'volledig vrouwelijke' juveniele productie. Dit zal naar verwachting een grote impact hebben op de productietijd, aangezien vrouwtjes sneller groeien en later volwassen worden -80 procent van de geslachte vissen <5 kg zijn volwassen mannetjes.

Het project DIVERSIFY heeft deze belangrijke knelpunten aangepakt met een gecoördineerde onderzoeksinspanning op het gebied van reproductie, voeding en houderij van larven en ontwikkeling van vaccins. De combinatie van biologische, technologische en sociaaleconomische onderzoeksactiviteiten die in DIVERSIFY zijn ontwikkeld, zullen naar verwachting de diversificatie van de aquacultuurindustrie in de EU ondersteunen en helpen bij de uitbreiding van de productie, toenemende aquacultuurproducten en ontwikkeling van nieuwe markten.

Reproductie

Onderzoek in ons project bevestigde dat in het wild gevangen vrouwtjes betrouwbaar paaien en eieren produceerden die constant van zeer hoge kwaliteit waren (>85% bevruchting). Gekweekte vrouwtjes produceerden ook eieren van hoge kwaliteit toen hun ovulatoire cycli werden vastgesteld, en het strippen werd uitgevoerd dicht bij de eisprong (zie figuur 2).

Voor commerciële productie, evenals fokdoeleinden, het is niet praktisch om te vertrouwen op in het wild gevangen vrouwtjes. Echter, relatief weinig gekweekte vrouwtjes produceerden eieren die consistent waren met bevruchtingspercentages van> 80-85 procent. Als gevolg hiervan, het kan nodig zijn om in het wild gevangen broedmateriaal ook op te nemen in toekomstige fokgroepen om te zorgen voor voldoende breed genetisch materiaal.

Plasmaconcentraties van geslachtssteroïden bij gekweekte fokkers waren vergelijkbaar met wat eerder is gerapporteerd in Atlantische heilbot, met jaarprofielen na groei en rijping van de eierstokken. De hoogste niveaus van 17β-estradiol (E2) werden geregistreerd vlak voor het uitzetten, begin februari, terwijl zowel E2 als testosteron (T) gedurende de paaiperiode verhoogd bleven.

Er werden geen verschillen in gemiddelde concentraties waargenomen tussen in het wild gevangen en gekweekte vrouwtjes. Plasmaconcentraties van het gonadotropines follikelstimulerend hormoon (FSH) en luteïniserend hormoon (LH) werden voor het eerst gedocumenteerd in Atlantische heilbot.

De gemiddelde FSH-concentraties waren relatief stabiel tijdens vitellogenese, van oktober tot begin februari, consistent met een constitutieve afgifte van FSH uit de hypofyse. Plasma-FSH nam af tot lage niveaus tijdens het uitzetten, maar nam weer toe nadat het afzetten was voltooid.

Plasma LH-concentraties vertoonden grote individuele variaties tijdens de voortplantingscyclus, maar tijdens het paaien werden hoge niveaus gedetecteerd. Dit was consistent met eerder gerapporteerde resultaten in andere teleosten, waaronder een aantal platvissen.

Implantatie met gonadotropine-releasing hormoonagonist (GnRHa) zorgde niet voor een significante verlenging van de paaitijd bij vrouwtjes van de Atlantische heilbot, maar een schijnbare synchronisatie in paaitijd tussen individuen werd gezien, aangezien de behandelde vrouwtjes een maand voordat de controlevissen werden doorgebracht, klaar waren met paaien. Bij commerciële productie, synchronisatie tussen individuen kan een voordeel zijn, aangezien de inspanningen van het personeel bij het verzamelen van eieren kunnen worden geconcentreerd op een relatief korte periode (zie figuur 3).

Fokkers van Atlantische heilbot moeten worden gecontroleerd op ovulatie en regelmatig worden gestript, en eieren worden in vitro bevrucht. Daarom, het gebruik van GnRHa-implantatie biedt een logistiek voordeel voor het commerciële beheer van de soort, door het paaiseizoen te verkorten.

Voeding

Voor de ontwikkeling van een protocol voor het vroeg spenen van larven van Atlantische heilbot, we vonden een groot verschil met betrekking tot de voeropname van de larven op drie verschillende commerciële diëten 28 dagen na de eerste voeding (dpff) (zie figuur 4).

Larven die het commerciële mariene larvendieet kregen Otohime (Japan) hadden volle ingewanden na vijf dagen voeren. Dit dieet werd gebruikt in een experiment om de vroegste tijd van spenen op 15-jarige leeftijd te vinden. 22 en 28 dpff. Het spenen met 15 dpff resulteerde in bijna 100 procent sterfte, bij 22 dpff ongeveer 30 procent sterfte en bij 28 dpff, bijna nul procent sterfte.

De conclusie was dat de voedingskenmerken belangrijk zijn om de voeropname van de larven van de Atlantische heilbot te verzekeren en dat de larven pas bij 28 dpff klaar zijn om zich te voeden met een geformuleerd voer. Verdere experimenten zijn nodig om te evalueren of de vroege larven goed groeien en zich ontwikkelen op deze diëten.

Ook, een protocol voor de productie van doorgegroeide Artemia werd ontwikkeld en de samenstelling van de voedingsstoffen werd geanalyseerd. Artemia gedurende drie dagen gekweekt op het kweekmedium ORI-cultuur (Skretting, Spanje) en daarna verrijkt met het medium LARVIVA Multigain (Biomar, Denemarken) in veel opzichten een verbeterd voedingsprofiel verkregen.

het eiwit, gehalte aan vrije aminozuren en taurine verhoogd, lipide en glycogeen verlaagd, terwijl de verhouding van fosfolipiden (PL) tot totale lipiden (TL) toenam. De vetzuursamenstelling verbeterde bij één experiment, maar niet bij de uitvoering bij de commerciële partner. De micronutriëntenprofielen werden niet negatief beïnvloed door het kweken van Artemia op het ORI-kweekmedium.

Aangezien eerder onderzoek had uitgewezen dat larven die op de volwassen Artemia waren gevoerd zich ontwikkelden tot juvenielen met een betere kwaliteit, in DIVERSIFY kregen de larven Artemia in vergelijking met conventionele Artemia nauplii (zie figuur 5).

Er waren geen verschillen in groei, pigmentatie of oogmigratie tussen de twee groepen en de voedingssamenstelling van de larven na drie weken voeding waren zeer vergelijkbaar. De conclusie was dat Artemia-nauplii die met moderne methoden zijn geproduceerd, voldoende voedingsstoffen bevatten om in de behoeften van larven van Atlantische heilbot te voorzien.

Ook, de hypothese dat larven gekweekt in recirculatie aquacultuursystemen (RAS) een andere microflora in de darm zouden hebben en, daarom, verschillende opname van nutriënten hebben onderzocht. Echter, behalve hogere niveaus van het vitamine K-derivaat MK6, we vonden geen verschillen in nutriëntgebruik tussen larven gekweekt in RAS of doorstroomsystemen.

Eindelijk, Atlantische heilbotjuvenielen (één gram lichaamsgewicht) kregen diëten met vijf PL-niveaus variërend van 9 tot 32 procent van de TL. Er waren geen effecten van PL-spiegels op groei of lipidensamenstelling in de darm, lever en spieren, 24 uur na het voeden.

Echter, tijd na de maaltijd beïnvloedde de lipidensamenstelling van het darmweefsel, met hogere niveaus van neutrale lipiden één en vier uur postprandiaal, en hogere niveaus van polaire lipiden, cholesterolesters en ceramide 24 uur postprandiaal, als gevolg van de opname van de lipiden vroeg na de maaltijd.

Het lijkt erop dat jonge heilbotten van de Atlantische heilbot hun samenstelling van lipidensoorten zodanig reguleren dat ze onafhankelijk zijn van het dieet wanneer een reeks PL/Triacyl Glycerol wordt toegepast, zoals in de huidige studie (zie figuur 6).

Larvale houderij

Een protocol voor het kweken van Artemia nauplii werd ontwikkeld en beschreven. Het gebruik van opgroeiende Artemia tijdens de kritieke periode van metamorfose bij larven van de Atlantische heilbot verschilde niet van het gebruik van Artemia-nauplii wat betreft groei, sterfte en bakkwaliteit. In aanvulling, de productie van opgekweekte Artemia was arbeidsintensief, en hoge personeelskosten kunnen onbetaalbaar zijn bij de implementatie van deze bron van levend voer in commerciële larvicultuur.

De commerciële productie van frituur van Atlantische heilbot vindt momenteel plaats in doorstroomsystemen (FT), terwijl er een groeiende consensus is dat een RAS stabielere milieu- en chemische waterparameters zou bieden die zouden leiden tot verbeterde larvale prestaties.

Productieprotocollen voor dooierzak en eerste voedende larven in RAS werden ontwikkeld in DIVERSIFY. Er werden geen verschillen in overleving gevonden tussen RAS- en FT-opfok tijdens dooierzakincubatie. Toen de systemen een maand werden geprimed, larvale groei was significant hoger in de RAS-groep tijdens de eerste voeding. Hoge sterfte deed zich voor in een van de FT-tanks.

Bij elkaar genomen, resultaten suggereerden dat met adequate conditionering van de RAS, er ontstaat een stabiel systeem waar de groei en overleving van larven zo goed is als, of beter dan in FT-systemen met optimale omstandigheden. Het RAS was een stabieler kweeksysteem voor Atlantische heilbotlarven in vergelijking met het FT-systeem.

Metagenomische karakterisering van de bacteriële gemeenschappen in kweekwater en larven onthulde dat er minstens 300-400 verschillende bacteriële genera aanwezig waren in de kweeksystemen. Er werden significante verschillen gedetecteerd in de microbiota-samenstelling van de RAS- en FT-systemen:zowel in silo's als tanks, en in het water en de larven.

Er werd geen duidelijke correlatie gezien tussen de microbiota in het water en de microbiota van de larven. Karakterisering van de samenstelling van de microbiota levert belangrijke informatie op voor de ontwikkeling van probiotische behandeling van larven van Atlantische heilbot.

Gezondheid van vissen

Om een ​​vaccin te ontwikkelen tegen virale neurale necrose voor larven van Atlantische heilbot, het capside-eiwit van Nodavirus werd met succes recombinant tot expressie gebracht in drie verschillende systemen; E coli, Leishmania tarentolae en in tabaksplant, en zoals verwacht was er variatie in de hoeveelheid expressie tussen de systemen.

In aanvulling, het recombinante capside-eiwit tot expressie gebracht in Pichia werd geleverd door het EU-project TARGETFISH. Deze vier expressiesystemen verschillen in de manier waarop de tot expressie gebrachte eiwitten post-translationeel geglycosyleerd worden. Door het construeren en gebruiken van E. coli en Leishmania tarentolea die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen, met fluorescentiemicroscopie kon worden gevisualiseerd dat Artemia deze microben efficiënt filterde en opnam, en daardoor het herbergende recombinante eiwit.

Artemia nam recombinant Nodavirus-capside-eiwit op dat tot expressie werd gebracht door de verschillende systemen, wat kan worden bevestigd door immunoblotting.

Het recombinante capside-eiwit dat door het andere systeem tot expressie werd gebracht, werd vervolgens aan Artemia gevoerd, die met 100 dph aan de larven van de Atlantische heilbot werden gevoerd. Tien weken later, de jongeren in alle behandelingsgroepen werden uitgedaagd door een i.p. injectie (zie figuur 7) met Nodavirus om de werkzaamheid te controleren.

De uitgedaagde vissen werden acht weken na de challenge beëindigd en getest op de aanwezigheid van Nodavirus in de hersenen door middel van realtime RT-PCR gericht op het virale RNA2-segment. Er was geen significant verschil te zien tussen de verschillende behandelgroepen, inclusief de groep met recombinant eiwit die eerder bescherming heeft getoond.

Dit geeft aan dat de grootte van de vissen en de noodzaak om de vissen te sorteren om de enorme variatie tussen individuen in verschillende fasen op het moment van vaccinatie tot een minimum te beperken, inherente beperkingen hebben en zorgvuldig moeten worden overwogen.

Tot slot, hoewel is aangetoond dat Artemia de verschillende vormen van recombinante Nodavirus-capside-eiwitten zal opnemen en accumuleren en als vector zal werken voor orale afgifte aan larven van Atlantische heilbot, de challenge-experimenten geven aan dat deze strategie van antigeenafgifte geen bescherming tegen Nodavirus-infectie induceert, tenminste onder de omstandigheden die in dit onderzoek zijn gebruikt.

Er is een technische productiehandleiding gemaakt voor Atlantische heilbot en deze kan worden gedownload van de website van het project op www.diversifyfish.eu.

Dit 5-jarige project (2013-2018) heeft financiering ontvangen van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie (KBBE-2013-07 eentraps, GA 603121, DIVERSIFICEREN).

Het consortium omvat 38 partners uit 12 Europese landen – waaronder negen MKB-bedrijven, twee grote ondernemingen, vijf beroepsverenigingen en één consumenten-ngo- en werd gecoördineerd door het Hellenic Centre for Marine Research, Griekenland.