Onderzoek:protease veelbelovend als voeradditief voor pluimveehouderij

Het subtilisine-achtige proteïnase (AprBp) van Bacillus pumilus 3-19 is een veelbelovende kandidaat voor industrieel gebruik als voeradditief. Echter, om een ​​hoge opbrengst van het enzym te verkrijgen, het is noodzakelijk om een ​​zeer efficiënt expressiesysteem te ontwikkelen.

Het doel van de studie was om stabiele expressie van het B. pumilus 3-19 protease-gen in het Pichia pastoris-expressiesysteem te verkrijgen en de correlatie van enzymactiviteit met de keuze van vectortype en signaalpeptiden te evalueren. In dit onderzoek, voor de stabiele expressie van het geoptimaliseerde proteasegen in methylotrofe gistcellen, de vectoren pPINK-HC en pPINK-LC werden geselecteerd. Voor extracellulaire secretie van recombinant protease, een set effectieve signaalpeptiden werd gebruikt. Presequentie van de α-paringsfactor heeft herhaaldelijk geleid tot een toename van de secretie van recombinante eiwitten. Anderzijds, de sequenties van killer- en lysozyme-signaalpeptiden zijn niet eerder gebruikt voor de expressie van bacteriële protease in P. pastoris.

Kolonies van transformanten met constructen gebaseerd op de pPINK-LC-vector werden gedetecteerd op de 3e dag van incubatie en vertoonden een hogere transformatie-efficiëntie dan voor kolonies met constructen gebaseerd op de pPINK-HC-vector, die pas op de 7e dag van incubatie werden gedetecteerd. De transformatie-efficiëntie op de 10e dag van incubatie voor structuren op basis van de pPINK-LC-vector was gemiddeld 1,3 x 103 transformanten/μg DNA, terwijl 1,03 x 103 transformant/μg DNA werd geregistreerd voor constructen met de pPINK-HC-vector. Kolonie-PCR toonde aan dat alle geselecteerde transformantkolonies het subtilisine-achtige proteasegen bevatten dat in het gistgenoom was geïntegreerd.

De studie toonde aan dat de incubatietijd de synthese van protease in P. pastoris beïnvloedt, en de maximale activiteit van het enzym werd waargenomen. Giststammen met constructies gebaseerd op de low-copy vector pPINK-LC vertoonden een hogere protease-activiteit (U/ml) bij de hydrolyse van azocaseïne (2,63 ± 0,16 voor killer-signaalpeptide (SP), 2,49 ± 0,08 voor α-paringsfactor-presequentie, 2,19 ± 0,11 voor lysozyme SP) dan stammen met constructies gebaseerd op de pPINK-HC-vector (1,86 ± 0,09 voor killer SP, 2,21 ± 0,07 voor α-paringsfactor-presequentie, 1,31 ± 0,11 voor lysozym SP), ongeacht welk signaalpeptide werd gebruikt. De maximale protease-activiteit werd verkregen voor giststammen met pPINK-LC-killer-aprBp (5,75 ± 0,08 U/ml) en pPINK-LC-a-mat.factor-aprBp (4,33 ± 0,07 U/ml) constructen.

Deze studie toonde aan dat het subtilisine-achtige protease van recombinante P. pastoris-stammen proteolytische activiteit vertoont, die afhangt van de incubatietijd en de keuze van signaalpeptide en vector. De productie van bacillaire protease door het heterologe op gist gebaseerde expressiesysteem maakt dit systeem veelbelovend voor de ontwikkeling van nieuwe voeradditieven voor de veehouderij.

Proteasen worden gerekend tot de drie grootste groepen industriële enzymen en zijn goed voor ongeveer 60% van de totale wereldwijde verkoop van enzymen, Waarvan 40% tot bacteriële proteasen behoort. Bacteriële serineproteasen hebben een brede substraatspecificiteit, en hoge weerstand tegen verschillende omstandigheden, die hun gebruik in de biotechnologie rechtvaardigt, in het bijzonder als bio-additieven voor landbouwhuisvogels en dieren. Aanvullend, het aanvullen van diervoeders met proteasen verbetert de opname van aminozuren door dieren en bespaart geld voor de aankoop van synthetische aminozuren. Er is ook aangetoond dat het gebruik van proteasen als toevoegingsmiddelen de biologische beschikbaarheid van stikstof verhoogt, die op zijn beurt de niveaus van ammoniakverontreiniging in de bodem vermindert. Ook, proteasen vergemakkelijken de werking van andere enzymen en verhogen de kosteneffectiviteit van diervoeders, evenals het bevorderen van de groei van gunstige microflora in de darmen van slachtkuikens.

Vandaag, in Rusland wordt een beperkt aantal commerciële proteasen van buitenlandse fabrikanten gebruikt. De belangrijkste vertegenwoordigers op de Russische markt zijn de geïmporteerde toevoegingsmiddelen CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), VS), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Zwitserland), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Duitsland). De verkregen recombinant omvat P. pastoris-stammen met het subtilisine-achtige bacillaire protease (aprBp) gen en drie verschillende signaalpeptiden (α-paringsfactor, killer-eiwit en lysozym). Verdere expressie en zuivering van het protease uit gistkweekvloeistof en de studie van zijn biochemische en enzymatische eigenschappen zullen de biotechnologische vooruitzichten van het recombinante enzym helpen beoordelen.

Lees meer over het onderzoek, Heterologe expressie van Bacillus pumilus 3-19-protease in Pichia pastoris en het potentiële gebruik ervan als toevoegingsmiddel voor diervoeding in de pluimveehouderij