Welkom bij Moderne landbouw !
home

Evaluatie van functionele toevoegingsmiddelen tegen garnalenpathogenen met de nadruk op Vibrio parahaemolyticus en White Spot Syndrome Virus (WSSV) in Litopenaeusvannamei

door Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Blue Aqua International bedrijvengroep, Thailand

De aquacultuur van garnalen is dramatisch aangetast door vele pathogene ziekten, voornamelijk veroorzaakt door V. parahaemolyticus en White Spot Syndrome Virus (WSSV). Het doel van deze studie was om het mogelijke gebruik te evalueren van twee functionele toevoegingsmiddelen voor diervoeding, AlphaGuard*L Plus (vloeibaar) en AlphaGuard*P (poeder), samengesteld uit essentiële oliën (eucalyptus, tijm, oregano die respectievelijk behoren tot de familie Myrtaceae en Lamiaceae), Medium Chain Triglyceriden (MCT's) en natuurlijke bioactieve stoffen in garnalen tegen ziekteverwekkers, vooral V. parahaemolyticus en WSSV.

De resultaten gaven aan dat AlphaGuard*L Plus het ziekteverloop bij garnalen effectief vertraagde. Deze resultaten suggereren dat het functionele voeradditief van AlphaGuard*P en AlphaGuard*LPLUS kan worden gebruikt om de afweer van garnalen tegen ziekteverwekkers te bevorderen.


Invoering

De praktijk van intensivering van de aquacultuur wordt belemmerd door gezondheid en voeding die de groeiprestaties beïnvloeden. Om deze gevolgen te ontwarren, functionele toevoegingsmiddelen zijn gebruikt om het immuunsysteem van garnalen te stimuleren en de prestaties van garnalen te verbeteren, speciaal om virale en bacteriële pathogenen te bestrijden. Recente behandeling van garnalenziekten zoals V. parahaemolyticus die acute hepatopancreatische necroseziekte (AHPND) veroorzaakte en White Spot Syndrome Virus (WSSV) die White Spot veroorzaakt Ziekte (WSD), gecombineerd met de implementatie van bioveiligheidsmaatregelen.

De samenstelling van AlphaGuard, bestaande uit MCT en essentiële olie, wordt erkend als GRAS-praktijk. In dit onderzoek, de efficiëntie van het AlphaGuard-product werd verkregen door een combinatie van de gegevens van schijfdiffusietestresultaten, ziekte-uitdagingen en histologie, samen met een evaluatie van de producteffecten van AlphaGuard op de garnalenziekten.


materialen en methodes

Pathogene bacteriën en virussen
Twee virulente ziekteverwekkers in garnalen, V. parahaemolyticus en V. harveyi in glycerolvoorraad, zijn sub-gekweekt in Tryptic Soy Broth (TSB) + één procent NaCl, 24 uur bij 37°C geïncubeerd, voordat uitgestreken op thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose-agar om de zuivere cultuur te verkrijgen.

WSSV-suspensie werd bereid uit de spier van met WSSV geïnfecteerde garnalen. Kort, het WSSV-bevattende in garnalenspier werd uit de opslag verwijderd bij -80°C en onder koude steriele omstandigheden in uniforme stukken gesneden en vervolgens gehomogeniseerd in TN-buffer (20 mM Tris-HCl, 400 mMNaCl, pH 7,4) bij 0,1 g/ml.

Na centrifugeren bij 2, 000 rpm gedurende 10 minuten bij 4°C, het supernatant werd verdund tot 1:100 met 0,9 procent NaCl en gefiltreerd door 0,45 micron. Het resulterende supernatant werd bewaard bij -80°C, totdat het werd gebruikt als een bron van WSSV-injectie voor de uitdagingsexperimenten.


De antimicrobiële activiteit

Schijfdiffusietest
5 µl van AlphaGuard*L Plus en AlphaGuard*P, concentratie variërend van 0, 0,25, 0,5, 1,0 en 10 procent verdunning met NaCl 0,85 procent, werden geabsorbeerd in een diameter van vijf millimeter, Papieren schijfjes met een dikte van 0,9 mm werden vervolgens aan de lucht gedroogd voordat ze in 105 cellen van bacteriecultuur werden geplaatst in een petrischaaltje van 100 x 15 mm breed. 0,85 procent NaCl-oplossing werd gebruikt als negatieve controle. Er werden drie replicaplaten voor elke behandeling gebruikt en de waarnemingen werden na 24 uur geregistreerd.


Kunstmatige infectie met V. parahaemolyticus en bepaling van het aantal Vibrio in hemolymfe (HL) en hepatopancreas (HP) van garnalen

V. parahaemolyticus werd gereactiveerd na opslag bij -80°C en overnacht gekweekt in TSB + één procent NaCl bij 37°C. De kweek werd gecentrifugeerd bij 5, 000 tpm gedurende 10 minuten, om het supernatant te verwijderen, en de pellet werd opnieuw gesuspendeerd in steriel 0,85 procent NaCl tot een dichtheid van 8,4 x 106 CFU/ml.

De garnaal, op de vijfde week, werden geïnfecteerd door 100 L van de bacteriële suspensie te injecteren in het tweede abdominale segment van gezonde garnalen in de vijfde week van kweek en mortaliteit werd gedurende zeven dagen geregistreerd.

Garnalen werden willekeurig verzameld op de derde dag na infectie voor elke behandeling en driemaal gewassen met steriel water. HL werd onder steriele omstandigheden uit de pericardiale holte onttrokken met een steriele wegwerpspuit van één ml en toegevoegd aan een gelijk volume steriel anticoagulans (toevoeging van 10 mM EDTA-Na2 tot 450 mMNaCl, 10 mMKCl, 10 mM HEPES, pH 7,3, 850 mOsm.kg-1 of 10 mM Tris-HCl, 250 mM sucrose, 100 mM Natriumcitraat, pH 7,6).

De HL en gemalen HP werden serieel 10-voudig verdund met koude steriele PBS. Elke verdunning werd uitgespreid op TCBS-agarplaten die ondersteboven in een incubator van 37 ° C waren geplaatst en gedurende 16-20 uur werden gekweekt. Platen met 30-300 bacteriekolonies werden geteld, vervolgens werden de getallen geregistreerd als CFU/ml of CFU/g.


Kunstmatige infectie met WSSV

ml van het filtraat werd in de vijfde kweekweek intramusculair in gezonde garnalen geïnjecteerd. Garnalen werden willekeurig zes uur na infectie verzameld voor histopathologisch onderzoek en de mortaliteit f werd gedurende zeven dagen geregistreerd.


Garnalengroeiomstandigheden en experimentele groepen

Garnalen werden gekocht van lokale Thaise boerderijen. Ze werden negatief getest op V. door parahaemolyticus veroorzaakte AHNPD en WSSV door PCR-analyse. Na een week in een aquarium te hebben geacclimatiseerd, voorafgaand aan het experiment, schijnbaar gezonde garnalen met uniforme lichaamslengte werden willekeurig verdeeld in drie groepen met zes replica's per groep, 20 garnalen per replica.

De inhoud van het aquarium was 100 liter, met 60 liter zeewater. Zoutwater eigendom werd gehandhaafd op 15 ppt, pH 7,7-8,0 en DO>4,0 mg/L. Elke behandeling bevat juveniele garnalen met een gemiddeld begingewicht van 2,6 g willekeurig in elke tank opgeslagen.

Garnalen werden tot ongeveer 2,5-3 procent van hun lichaamsgewicht tot verzadiging gevoerd, drie keer per dag gedurende vijf weken. De voeding werd dagelijks aangepast, volgens hun ingenomen snelheid, om ervoor te zorgen dat het voer volledig werd geconsumeerd. Voor het voeden, vervellingen, ontlasting, en dode garnalen werden verwijderd, Elke drie dagen werd 20 procent van het water in elke tank vervangen door nieuw zeewater.


Experimentele diëten en gegevensverzameling

Alle groepen werden gehouden, tijdens het experiment, onder dezelfde voorwaarden als acclimatisatie. De controlegroep werd gevoed met commerciële garnalenpellets, bedekt met één procent chitine-chitosan. Behandelgroepen werden gevoed met AlphaGuard*L Plus opgespoten of AlphaGuard*P, gemengd met commerciële garnalenpellets en gecoat met één procent chitine-chitosan, bij dosering 5,0 ml of g/kg voer. Dagelijks werden sterfte- en waterkwaliteitsparameters geregistreerd. Aan het einde van de proef, het overlevingspercentage werd geëvalueerd.


statistische analyse

Statistische analyse experimentele eenheden, tanks, en aquaria werden volledig willekeurig verdeeld. Kwantitatieve gegevens werden gecontroleerd op normaliteit en homoscedasticiteit. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) om te zoeken naar significante (p <0,05) verschillen tussen behandelingsmiddelen.


Resultaten

De antibacteriële activiteit door schijfdiffusiemethoden en opname in garnalendieet op ziekteresistentie van AlphaGuard*L Plus of AlphaGuard*P


Schijfdiffusietest

De concentraties van AlphaGuard*L Plus en AlphaGuard*P remmen ten minste één procent zowel V. harveyi als V. parahaemolyticus, echter, er was een hogere remmingswerkzaamheid voor V. parahaemolyticus vergelijk dan voor V. harveyi. De effectieve concentratie van AlphaGuard zou kunnen zijn verlaagd als we hadden verdund in lipide oplosbare stoffen, zoals ethanol, om uit te proberen.

Essentiële olie composities, testtechnieken en het werkingsmechanisme zijn intensief beoordeeld. Deze studie heeft geen moleculair detail onderzocht voor zijn mechanismen, echter, het belangrijkste effect van bacteriocide eigenschappen kan verband houden met hun interferentie van membraanintegriteit en permeabiliteit als de lipofiele verbinding van etherische olie en MCT's.

Verschillende vetzuren in MCT's hebben een verschillende minimale remmende concentratie (MIC), afhankelijk van het type vetzuur, micro-organisme, en omgevings-pH. Het synergetische en antagonistische aspect tussen ingrediënten in AlphaGuard wordt in deze studie niet toegelicht. De essentiële olie in AlphaGuard werkt ook als een antioxidant om oxidatie van onverzadigde MCT's te voorkomen of te vertragen om de houdbaarheid te verlengen, naast antistress bij garnalen.


V. parahaemolyticus challenge-test

Aan het einde van het voerproefexperiment, garnalen werden uitgedaagd door V. parahaemolyticus. Het cumulatieve sterftecijfer werd uitgezet (zie figuur 2). De resultaten van het sterftecijfer, na de V. parahaemolyticus-uitdaging gedurende een interval van zeven dagen, toonde aan dat groepen garnalen gevoed door AlphaGuard*P en AlphaGuard*L Plus significant lagere sterftecijfers hadden dan in vergelijking met de controlegroep na dag vier van infectie.

Zowel AlphaGuard*P als AlphaGuard*L Plus hadden hetzelfde statistische sterftecijfer na dag vijf van infectie. Aan het einde van het experiment, in tegenstelling tot, het overlevingspercentage was niet statistisch gecorreleerd met het sterftecijfer voor AlphaGuard*P, (zie figuur drie).

Het vermogen van garnalenontruiming van Vibrio spp. na drie dagen infectie werd uitgezet, (zie figuur vier). De resultaten gaven aan dat de Vibriospp. telling in de hemolymfe van garnalen gevoed door AlphaGuard*P en AlphaGuard*LPlus waren lager dan de gecontroleerde groepen. Het vermogen van garnalen om zich te verdedigen tegen bacteriën in HP, gevoed door AlphaGuard*LPlus, hadden ook een veel beter verdedigingsvermogen dan garnalen die AlphaGuard niet kregen.


WSSV-uitdagingstest

De WSSV-uitdagingstest werd uitgevoerd na vijf weken van de voedingsproef. De cumulatieve sterfte werd uitgezet, (zie figuur vijf). De groep garnalen gevoed door AlphaGuard*L Plus vertoonde significante vertraging in sterfte, vergeleken met de controlegroepen en AlphaGuard*P-gevoede garnalen tijdens hun tweede, derde en vierde dag, (zie figuur zes).

Dit valt samen met geen histopathologisch teken van H&E-kleuring van WSSV-infectieweefsel op het injectiegebied, behalve de veralgemening van spiernecrose die waarschijnlijk verband houdt met het afweermechanisme van de garnalen na drie dagen infectie. Hoe dan ook, alle groepen eindigden met 100 procent sterfte.


Conclusie

De resultaten van deze proef suggereerden dat de toepassing van AlphaGuard*P en AlphaGuard*L Plus voeradditief van 0,5 procent met commercieel voer de werkzaamheid bewees bij het bevorderen van de verdediging van garnalen tegen ziekteverwekkers. Vooral AlphaGuard*L Plus liet een betere prestatie zien.


()
Visserij
Moderne landbouw

Moderne landbouw